Ativação metabólica da diferenciação 3D de células estaminais em tecido ósseo

Descrição

Estratégias que envolvam a diferenciação osteogénica de células estaminais mesenquimais (MSCs) representam ferramentas promissoras na medicina regenerativa, tanto através da promoção da regeneração in situ, como da implantação de tecido recém-desenvolvido, potencialmente contornando implicações clínicas associadas a terapias mais convencionais. Ainda assim, células e tecidos ósseos provenientes de bioengenharia nem sempre alcançam os pré-requisitos necessários para uma regeneração óssea in vivo bem sucedida, originando novos tecidos fracos ou inadequados e/ou problemas de biocompatibilidade. Portanto, torna-se imprescindível compreender melhor a diferenciação das MSCs, de forma a otimizar a condução para a linhagem osteogénica. O recurso a metabolitos foi recentemente reconhecido neste contexto, dado o seu potencial de induzir a osteogénese, garantindo também que a co-diferenciação noutras linhagens seja inexistente ou residual; isto é, estes metabolitos devem ser simultanemante potentes e específicos.Este projeto visa otimizar um biorreator para conduzir a diferenciação osteogénica de MSCs adiposas humanas (hAMSC) enquanto permite avaliar detalhadamente o metaboloma celular. Com base numa metodologia metabolómica completa, identificaremos e exploraremos metabolitos osteoindutores que garantirão a predominância de células semelhantes a osteoblastos, eliminando a necessidade do uso de fatores osteogénicos que podem levar à diferenciação indesejada, tal como a dexametasona (tradicional indutor osteogénico). Tendo por base as variações observadas no endo- e no exometabolomas de hAMSCs em culturas 2D, foram já propostas (pelo nosso próprio grupo) hipóteses bioquímicas potencialmente explicativas das adaptações metabólicas que acompanham o processo osteogénico, revelando metabolitos potencialmente osteoindutores. O presente projeto pretende transferir o conhecimento referente a culturas 2D para culturas 3D, recorrendo a um método inovador de encapsulamento para suportar hAMSC em mono- ou co-cultura (com células endoteliais, conhecidas por fornecer fatores osteogénicos), tanto na ausência, como na presença de sinais mecânicos. Ainda que a importância destas variáveis na osteogénese já seja reconhecido, a base bioquímica que lhes está associada é ainda pouco compreendida (nomeadamente o papel dos metabolitos e proteínas, tanto intra-, como extracelulares), dificultando assim a otimização informada do processo para aplicações biomédicas. Consoante as variações metabólicas intracelulares(endometaboloma) e extracelulares (exometaboloma, incluindo o secretoma) observadas ao longo do tempo, a presente análise metabolómica ajudará não só a confirmar os metabolitos osteoindutores propostos nas culturas 2D e verificar a sua translação para 3D, como também a revelar novos candidatos (relacionados com o ambiente 3D como resultado de interações célula-célula e célula-nicho) com potencial para estimular eficaz e especificamente a diferenciação osteogénica em culturas 3D (com nenhuma ou mínima co-diferenciação noutras linhagens). As hipóteses metabólicas provenientes da metabolómica serão confirmadas com recurso a marcações isotópicas de metabolitos específicos e proteómica dos ambientes intra- e extracelulares (incluindo das vesículas produzidas ao longo da diferenciação, essenciais para a mineralização). De forma complementar às ciências ómicas, tirar-se-á partido da micro-espectroscopia de infravermelho baseada em radiação de sincrotrão para entender o papel específico de lipídios e proteínas nas membranas plasmáticas (e sua fluidez), do citoesqueleto e da matriz extracelular de colagénio ao longo da diferenciação osteogénica, bem como a dependência de cada um destes elementos em relação às variáveis de cultura 3D (mono/co-culturas, ausência/presença de sinais mecânicos). A combinação das poderosas técnicas acima mencionadas representa uma abordagem inovadora para caracterizar a diferenciação osteogénica de MSCs, fornecendo uma visão única das adaptações bioquímicas das células estaminais e suas interações célula-nicho durante a differenciação, permitindo a otimização da osteoindução utilizando os próprios metabolitos celulares. Este projeto culminará no desenvolvimento de um biorreator otimizado através da suplementação com metabolitos osteoindutores (e idealmente evitando ou minimizando o uso dos fatores osteogénicos tradicionais), de forma a obter tecido ósseo de alta qualidade, através de um protocolo cientificamente informado e fácil de monitorizar dinamicamente por metabolómica do exometaboloma, de forma a aumentar a sua eficácia em aplicações biomédicas.